1 引言
鉻鹽在制革工業(yè)中的有效利用率僅為60%左右，其余則以Cr3+的形式殘留在廢水和污泥中，并在環(huán)境和生物體內(nèi)富集，從而嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展.同時，制革工業(yè)中還使用了許多表面活性劑，所使用的表面活性劑中，辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)的使用量最大.由于辛基酚聚氧乙烯醚具有難降解、疏水性、脂溶性和生物累積性等特點(diǎn)，大量使用產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境污染.而在含Cr3+的制革廢水中，OPnEO等有機(jī)污染的存在使Cr3+在環(huán)境中的行為變得更為復(fù)雜，增加了廢水治理的難度.
目前，國內(nèi)外對Cr3+和OPnEO的處理方法主要有物理吸附法、化學(xué)沉淀法以及生物處理法，其中生物法因來源廣泛、成本較低、無二次污染等特點(diǎn)備受關(guān)注.其中，生物處理法大多集中于針對單一污染物的去除，而實(shí)際要處理的對象為多種污染物組成的復(fù)合體系，以往針對單一污染物的研究成果應(yīng)用到實(shí)際環(huán)境治理時會因?yàn)槠渌廴疚锏拇嬖诙_(dá)不到預(yù)期的效果，因此，對于研究微生物混合菌去除環(huán)境中的復(fù)合污染物更具有實(shí)際應(yīng)用價值.
本論文以實(shí)驗(yàn)室篩選保存的微紫青霉菌B5和醋酸鈣不動桿菌H1按不同比例配置成混合菌，開展混合菌同時去除Cr3+與OPnEO的實(shí)驗(yàn)研究，獲得以1:1配制成的混合菌Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除效果最好，由此采用不同的固定載體對混合菌Z1進(jìn)行包埋，研究影響固定化混合菌Z1對Cr3+和OPnEO同步去除的主要環(huán)境因素，并對Cr3+和OPnEO的去除條件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，從而確定固定化混合菌Z1對Cr3+和OPnEO同步去除的最佳條件組合，研究結(jié)果為典型復(fù)合污染物的治理提供了新的思路和理論依據(jù).
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 菌株來源
微紫青霉菌B5(Penicillium janthinellum);醋酸鈣不動桿菌H1(Acinetobacter calcoaceticus)，菌株B5和H1按照1:1配置成混合菌Z1.
2.1.2 培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基：酵母浸出物，5.0 g;胰蛋白胨，10.0 g;NaCl，10.0 g;TX-100(OPnEO，n=9~10)，1.0 g;蒸餾水定容至1000 mL;調(diào)節(jié)pH值至7.2;121 ℃滅菌20 min，備用(LB固體培養(yǎng)基在制備LB培養(yǎng)基過程中添加瓊脂粉15~20 g).
PDA培養(yǎng)基：葡萄糖，20 g;馬鈴薯，200 g(馬鈴薯去皮切塊，加去離子水煮沸10 min，過濾);一定量堿式硫酸鉻，蒸餾水定容至1000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min，備用.
無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MS)：取K2HPO4，0.4 g;KH2PO4，0.4 g;NaCl，0.1 g;(NH4)2SO4，0.04 g;MgSO4·7H2O，0.1 g;MnSO4·H2O，0.01 g;Fe2(SO4)3·H2O，0.01 g;NaMoO4·2H2O，0.01 g;加水定容至1000 mL;121 ℃下滅菌20 min，備用.
2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
LRH-250-Z型恒溫振蕩培養(yǎng)箱;紫外可見分光光度計(上海);EASYpureⅡBarnstead ultrapure Water System，超純水凈化系統(tǒng);J2-MC型冷凍離心機(jī)(美國BECKMAN公司);AGILENT 1100型高效液相色譜儀(美國);分離柱：ZORBAX Edipse XDB-C18.
2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑
TX-100(OPnEO，n=9~10)，SIGMA試劑公司;十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS，TCI(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;改性秸稈載體，海藻酸鈉，聚乙二醇;堿式硫酸鉻，乙酸，其他試劑均為分析純.
2.2 試驗(yàn)方法2.2.1 固定化載體的制備
海藻酸鈉固定化小球的制備;聚乙二醇固定化小球的制備;改性秸稈的制備.
2.2.2 Cr3+和OPnEO的同步去除試驗(yàn)
在50 mL三角燒瓶中分別加入25 mL的OPnEO無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(OPnEO濃度為1000 mg·L-1)和25 mL的Cr3+(Cr3+濃度為1000 mg·L-1)無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，用1 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，塞上棉塞，包扎后，121 ℃滅菌30 min.待培養(yǎng)基冷卻后，在無菌操作臺中對培養(yǎng)基進(jìn)行編號標(biāo)記，分別加入相同質(zhì)量的固定化顆粒(20 g·L-1)，于28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為125 r·min-1的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每組設(shè)3個平行樣.
2.2.3 Cr3+和OPnEO同步去除率的計算
HPLC測定OPnEO的殘留量，二苯碳酰二肼法測定Cr3+的濃度.
(1)
式中，R為OPnEO的去除率;a為OPnEO初始濃度(mg·L-1);b為降解48 h后測定的OPnEO濃度(mg·L-1).
(2)
式中，Q為Cr3+的去除率;B為Cr3+初始濃度(mg·L-1);b為培養(yǎng)48 h后測定的Cr3+濃度(mg·L-1).
2.2.4 OPnEO標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定及最佳固定化材料的選擇
稱取1.0 g OPnEO(TX-100，n=9~10)用色譜甲醇溶解，蒸餾水定容至100 mL，制成標(biāo)準(zhǔn)液保存?zhèn)溆?向系列10 mL容量瓶中分別加入0、0.02、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 mL OPnEO標(biāo)準(zhǔn)液，色譜甲醛稀釋至刻度，0.22 μm微濾膜過濾，用HPLC測定，得到OPnEO的標(biāo)準(zhǔn)曲線，與去除實(shí)驗(yàn)測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果確定最佳固定化材料.
2.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化固定化混合菌Z1的去除條件
選取pH值、溫度、時間、OPnEO初始濃度、Cr3+初始濃度、外加氮源等6個對固定化混合菌Z1去除Cr3+和OPnEO影響最明顯的因素，根據(jù)Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計原理，對11個考察因素進(jìn)行N=12的組合實(shí)驗(yàn)，以Cr3+去除率為響應(yīng)值，從中篩選出對固定化混合菌Z1去除 Cr3+影響最顯著的3個因素;再通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計原理，以Box-Benhnken設(shè)計進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用Design Expert軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到固定化混合菌Z1去除Cr3+的最佳條件組合.
(1) Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計
通過單因素實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，菌株H1與B5具有較好的協(xié)同作用，對Cr3+和OPnEO的同步去除效果基本一致.根據(jù)Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計原理，以Cr3+的去除率為響應(yīng)值，采用N=12的組合實(shí)驗(yàn)，研究對固定化混合菌Z1去除Cr3+和OPnEO產(chǎn)生影響的6個條件，從中篩選出對固定化混合菌Z1去除 Cr3+和OPnEO產(chǎn)生影響的3個最顯著因素(表 1).
(2) 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)
為更充分模擬真實(shí)情況，根據(jù)Placket-Burman設(shè)計結(jié)果，利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)路徑方法確定重要因子的最適濃度范圍，從而更加精確地接近最佳值區(qū)域.
(3) 響應(yīng)面分析法確定固定化混合菌Z1的最佳去除條件
根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計，利用Design Expert 8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析求得最優(yōu)值，并繪制響應(yīng)面分析圖.
表 1 Placket-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計因素及水平
3 結(jié)果與討論
3.1 固定化菌Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除結(jié)果
以聚乙二醇、改性秸稈、海藻酸鈉為固定化材料，得到固定化混合菌Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除結(jié)果見表 2和圖 1.
表 2 不同固定化材料固定混合菌Z1對Cr3+的去除結(jié)果
從表 2和圖 1可知，分別以聚乙二醇、改性秸稈、海藻酸鈉為載體固定混合菌Z1對OPnEO的去除率為53.926%、46.99%、55.145%，而對Cr3+的去除率分別達(dá)到58.4%、54.2%、60.9%，所以在3種固定化材料中，以海藻酸鈉固定化混合菌Z1對Cr3+和OPnEO同步去除效果最好.關(guān)向杰等在研究中發(fā)現(xiàn)游離狀態(tài)下菌株H1對OPnEO的降解率為50%左右;而黃水娥等在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中的Cr3+濃度高于1000 mg·L-1時，在游離狀態(tài)下菌株B5對Cr3+的去除率低于50%，因此，選用海藻酸鈉為混合菌Z1的固定化載體.
圖 1 不同固定化材料固定混合菌Z1去除OPnEO的液相色譜圖(注：a表示以聚乙二醇為固定化材料，b表示以改性秸稈為固定化材料，c表示以海藻酸鈉為固定化材料)
3.2 海藻酸鈉固定化混合菌Z1去除 Cr3+的條件優(yōu)化3.2.1 環(huán)境因素對海藻酸鈉固定化混合菌Z1同步去除 Cr3+和OPnEO的影響
單因素實(shí)驗(yàn)得出，當(dāng)pH值為7時，Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除率達(dá)到最大值62.7%和58.1%;當(dāng)OPnEO初始濃度為950 mg·L-1時，Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除率達(dá)到最大值63.1%和58.9%;當(dāng)溫度為30℃時，Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除率達(dá)到最大值64.6%和59.3%;當(dāng)去除時間達(dá)到7 d后，Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除率在68.3%和73.5%左右，后期增長放緩;當(dāng)Cr3+初始濃度為900 mg·L-1時，Z1對Cr3+和OPnEO的同步去除率達(dá)到最大值70.14%和75.36%.外加氮源胰蛋白胨對Z1同步去除Cr3+和OPnEO的促進(jìn)效果最大，去除率分別達(dá)到70.36%和76.51%，實(shí)驗(yàn)同時還發(fā)現(xiàn)，外加有機(jī)氮源對Z1同步去除Cr3+和OPnEO有促進(jìn)作用，無機(jī)氮源反而產(chǎn)生了抑制作用.
3.2.2 固定化混合菌Z1去除Cr3+的Placket-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
海藻酸鈉固定化混合菌Z1對Cr3+和OPnEO的去除具有一定的協(xié)同作用(表 3)，在以往的研究中對于生物作用去除 Cr3+的研究相對較少，且Cr3+的污染危害更大，所以以Cr3+的去除率作為響應(yīng)值更有意義，由此在后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化去除條件過程中以Cr3+作為響應(yīng)值.利用Design Expert8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，Placket-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 3所示.
表 3 響應(yīng)值為Cr3+去除率條件下的Placket-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從表 3可知，實(shí)驗(yàn)組7中Cr3+的去除率最高，達(dá)到71.42%;實(shí)驗(yàn)組1中Cr3+的去除率最低僅為44.21%.運(yùn)用SPPS 19.1軟件進(jìn)行擬合，得到方程Y=73.37-9.16X1+6.35X2-2.15X3+0.37X4-3.37X5+21.33X6.
式中，X1表示pH值;X2表示溫度;X3表示OPnEO;X4表示胰蛋白胨濃度;X5表示去除時間;X6表示Cr3+初始濃度.
運(yùn)用Design Expert 8.0軟件分析得到模型的P值為0.0177，表明該回歸方程較顯著，在研究區(qū)域內(nèi)具有良好的擬合性.表 3和表 4的結(jié)果表明Cr3+濃度、pH值和溫度對Z1去除Cr3+的效果影響較大.確定初始Cr3+濃度、pH值與溫度為影響Z1對Cr3+去除率的關(guān)鍵因素.
表 4 響應(yīng)值為Cr3+去除率條件下的Placket-Burman結(jié)果分析
3.2.3 固定化混合菌Z1去除Cr3+的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果
初始OPnEO濃度950 mg·L-1、胰蛋白胨添加量為6%、培養(yǎng)時間為7 d，隨著初始pH和溫度的增加及Cr3+濃度的減小，Z1對Cr3+的去除率出現(xiàn)先增大后減小.當(dāng)初始pH值為7.5，Cr3+濃度為900 mg·L-1，溫度為30 ℃時，Z1對Cr3+的去除率達(dá)到最大值.由此可知，最大響應(yīng)值區(qū)域?yàn)榫幪?實(shí)驗(yàn)組，以這一組為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到Z1去除Cr3+的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計結(jié)果(表 5).
表 5 固定化混合菌Z1去除Cr3+的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果
3.2.4 固定化混合菌Z1去除Cr3+的最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
以Cr3+濃度、pH值和溫度2個因子為自變量，以Z1對Cr3+的去除率為響應(yīng)值，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)(表 6).運(yùn)用Design Expert 8.0軟件對相關(guān)響應(yīng)面值進(jìn)行回歸分析處理，得到二次多項式方程： Cr3+去除率=74.02-3.50A-12.52B-2.59C-2.19AB-0.018AC+3.41BC-13.47A2-11.76B2-13.21C2
表 6 固定化混合菌Z1去除Cr3+的Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果
式中，Y為Z1對Cr3+的去除率;A、B、C分別表示初始pH值、Cr3+濃度、溫度.系數(shù)R2=0.9612，表明方程具有良好的擬合度，可對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測.
Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果如表 7所示，根據(jù)表 7可知，p<0.0001，說明該模型顯著.結(jié)合圖 2，可更直觀的看出，各因素之間具有交互作用，且各因素對固定化混合菌Z1去除Cr3+效率的影響不是簡單的線性關(guān)系，對響應(yīng)值的影響存在1極值點(diǎn).
表 7 固定化混合菌Z1去除Cr3+的 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)回歸分析結(jié)果
圖 2 固定化混合菌Z1去除Cr3+的各影響因素及其交互作用的響應(yīng)面
3.2.5 固定化混合菌Z1去除Cr3+的最佳條件
根據(jù)表 7方差分析數(shù)據(jù)可知，固定化混合菌Z1對Cr3+的去除率影響因素大小的排序?yàn)椋篊r3+濃度(B)﹥pH值(A)﹥溫度(C).通過Box-Behnken軟件得出A=7.64，B=856.34，C=30.39，即：初始pH 7.64、Cr3+濃度856.34 mg·L-1、溫度30.39 ℃.此時，固定化混合菌Z1對Cr3+去除率的最大預(yù)測值為77.83%.
3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
按照優(yōu)化后的固定化混合菌Z1對Cr3+去除條件(初始pH 7.64、Cr3+濃度856.34 mg·L-1、OPnEO初始濃度為950 mg·L-1、溫度30.39 ℃、外加2 mL胰蛋白胨條件下培養(yǎng)7 d)進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際檢測Z1對Cr3+的去除率達(dá)到77.69%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值之間具有良好的擬合性，表明回歸方程能夠比較真實(shí)的預(yù)測各因素對海藻酸鈉固定化混合菌Z1對Cr3+去除的影響.將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)條件下未進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)面法優(yōu)化有利于海藻酸鈉固定化混合菌Z1對Cr3+的去除，去除率提高了7%，這說明響應(yīng)面法能有效預(yù)測并優(yōu)化固定化混合菌Z1對目標(biāo)化合物的降解.同時，在Cr3+的最佳去除條件下對海藻酸鈉固定混合菌Z1去除OPnEO的結(jié)果進(jìn)行檢測，得到OPnEO的去除率為76.68%，提高了1%左右，該結(jié)果進(jìn)一步說明了海藻酸鈉固定化混合菌Z1同步去除Cr3+和OPnEO過程中具有一定的協(xié)同作用，Shen等在其研究中也證實(shí)了這一點(diǎn).
4 結(jié)論
1) 以聚乙二醇、改性秸稈、海藻酸鈉3種材料為載體固定混合菌Z1，在搖床轉(zhuǎn)速125 r·min-1，28 ℃培養(yǎng)48 h，Z1對OPnEO的去除率分別為53.926%、46.99%、55.145%，而Z1對Cr3+的去除率分別達(dá)到58.4%、54.2%、60.9%.所以在3種固定化載體材料中，以海藻酸鈉為載體固定混合菌Z1對OPnEO和Cr3+的同步去除效果最好.
2) 通過單因素實(shí)驗(yàn)確定pH 7.0、溫度30 ℃、OPnEO初始濃度950 mg·L-1、Cr3+初始濃度900 mg·L-1為固定化混合菌在Z1對Cr3+和OPnEO同步去除的最佳條件，外加胰蛋白胨對海藻酸鈉固定混合菌Z1同步去除Cr3+和OPnEO的促進(jìn)效果最明顯.
3) 通過響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定海藻酸鈉固定混合菌Z1在初始pH 7.64、Cr3+濃度856.34 mg·L-1、溫度30.39 ℃、OPnEO初始濃度為950 mg·L-1、外加2 mL胰蛋白胨條件下培養(yǎng)7 d，固定化混合菌Z1對Cr3+的去除率達(dá)到77.69%，比單因素實(shí)驗(yàn)條件下固定化混合菌Z1對Cr3+的去除率提高了7%.
